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層析技術的概念,原理,分類

更新時間:2018-02-08點擊次數(shù):4244

一、概念
利用混和物中各組分理化性質(zhì)(吸附力、分子形狀、大小、分子極性、分子親和力以及分配系數(shù))的差異,在物質(zhì)經(jīng)過兩相中進行分離的一種技術。

本世紀初(1903年),植物學家M.C.Jber發(fā)現(xiàn)并使用這一技術證明了植物的葉子中不僅有葉綠素,還含有其他色素,實際上他使用的吸附層析?,F(xiàn)在層系法已成為生化、分子生物學及其它學科領域有效的分離、分析工具之一。

二、原理
具體過程:可分離物質(zhì):糖類、有機酸、氨基酸、核苷酸。


三、分類

1.  按兩相所處物理狀態(tài)分類

氣相層析:氣液層析(固定相為液體)和氣固層析(固定相為固體),流動相為氣體。

液相層析:液液層析(固定相為液體)和液固層析(固定相為固體),流動相為液體。

2.  按層析方式分類

柱層析:固定相裝于柱內(nèi),使樣品沿著一個方向移動而分離。

薄層層析:將適當粘度的固定相均勻鋪在薄板上,點樣后,用流動相展開。

紙層析:用濾紙作液體的載體,點樣后用流動相展開。

3.  根據(jù)層析原理分類:常用分類法
 

(1)吸附層析:固定相是固體吸附劑,通過對不同溶質(zhì)吸附力強弱不同進行分離。

(2)分配層析:利用兩相中的分配系數(shù)不同。

分配系數(shù):當一種溶質(zhì)在兩種給定的互不相溶的溶劑中分配時,在一定溫度下達到平衡后,溶質(zhì)在兩相中的濃度比值為一常數(shù),即分配系數(shù)(Kd)

Kd=Ca / Cb

Ca和Cb分別代表某一物質(zhì)在互不相溶的兩相,A相(動相)和B相(靜相)中的濃度。

(3)離子交換層析:固定相是離子交換劑,各組分與其親和力不同

(4)凝膠層析:固定相是多孔凝膠,根據(jù)流動相中溶質(zhì)的分子量大小差異進行分離

(5)親和層析:利用固定相載體表面偶聯(lián)具有特殊親和作用的配基,與溶質(zhì)分子發(fā)生可逆的特異性結(jié)合進行分離

(6)金屬螯合層析

(7)疏水層析

(8)反相層析

四、凝膠層析(又叫凝膠過濾或分子篩)

凝膠層析是指混和物隨流動相流經(jīng)固定相的層析柱時,混合物中各組分按其分子大小不同而被分類的技術。


1.  原理

凝膠層析的固定相是凝膠。凝膠是一種不帶電荷的具有三維空間多孔網(wǎng)狀結(jié)構的物質(zhì),凝膠的每個顆粒內(nèi)部都具有很多細微的小孔,如同篩子一樣。

常用凝膠有瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、葡聚糖凝膠等。

葡聚糖凝膠介質(zhì)是由多聚葡聚糖與環(huán)氧綠丙烷交連而成。zui常用的葡聚糖凝膠層析介質(zhì)是Sephadex G系列,不同型號的凝膠用G表示,G代表交聯(lián)度,從G10到G100。“G”后面的        數(shù)字表示每10g干膠的吸水量,可根據(jù)待分離混和物分子量大小選用不同“G”值的凝膠。


2.  分離過程:

樣品隨洗脫液的流動下移


3.  影響凝膠柱層析的主要因素

(1)層析柱的選擇與裝填
層析柱的大小應根據(jù)分離樣品量的多少及對分辨率的要求而定。凝膠柱填裝后用肉眼觀察應均勻、無紋路、無汽泡。

(2)流動相――洗脫液的選擇:是含有一定濃度鹽的緩沖液,目的是為了防止凝膠可能有吸附作用。其選擇主要取決于待分離樣品,一般來說只要能溶解洗脫物質(zhì),并不使其變性的緩沖液都可用于凝膠層析。

(3)加樣量:加樣量的多少應根據(jù)具體的實驗而定:一般分級分離時加樣量約為凝膠柱床體積的1%-5%,而分組分離時加樣量約為凝膠柱床體積的10%-25%.

(4)凝膠再生:葡聚糖凝膠再生使用NaOH(0.2M)和NaCl(0.5M)混合液處理。


五、離子交換層析

離子交換層析是利用固定相偶聯(lián)的離子交換基團和流動相解離的離子化合物之間發(fā)生可逆的離子交換反應而進行的分離方法。

1.  原理

離子交換交換層析是利用離子交換劑對各種離子的親和力不同,借以分離混和物中各種離子的一種技術。其主要特點是依靠帶有相反電荷的顆粒之間的吸引力的作用。

離子交換層析的固定相是載有大量電荷的離子交換劑,流動相是具有一定pH值和一定離子強度的電解質(zhì)溶液。

離子交換劑按其所帶電荷性質(zhì),分為:

陰離子交換劑帶正電荷,與混合物中帶負電的組分結(jié)合 陰離子交換層析。

陽離子交換劑 帶負電荷,與混合物中帶正電的組分結(jié)合 陽離子交換層析。

常用離子交換劑有:離子交換樹脂,離子交換纖維素等

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